银杏内酯B对小鼠成纤维细胞及毛囊干细胞增殖的影响
孙庆敏 朴永君 宋智琦
大连医科大学附属第一医院
背景与目的:既往研究显示,银杏内酯B能够增加毛乳头细胞的活性,促进血管内皮生长因子的释放从而促进毛囊周期转换。毛囊干细胞与毛发生长关系十分密切,但是银杏内酯B对毛囊干细胞的作用目前未见相关研究,因此本研究旨在探索银杏内酯B对小鼠成纤维细胞及毛囊干细胞增殖的影响。
方法:1.分离培养小鼠的原代成纤维细胞,分为四组:对照组、银杏内酯B组(10µM 、50µM、100µM),采用细胞增殖和细胞毒性实验测定比较各组成纤维细胞的增殖活性。2.利用细胞划痕实验模拟创伤模型,比较各组成纤维细胞的划痕愈合百分比。3. 60天雌性C57BL/6小鼠背部脱毛,选取50μM的银杏内酯B对脱毛区域进行皮下注射,采用左右对照的方法,给药4天后,取背部皮肤组织进行流式细胞术检测小鼠左右两侧背部皮肤毛囊干细胞的数量、毛囊前体细胞的数量以及两种细胞的增殖情况进行对比分析。4. 分别在给药第3天、第5天、第8天取小鼠左右两侧背部皮肤进行HE染色(hematoxylin-eosin staining),观察毛囊形态变化。5. 取注射4天后的左右两侧背部皮肤提取总RNA,利用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtime Polymerase Chain Reaction ,Rt-PCR)分析Wnt通路及毛囊干细胞相关mRNA的相对表达量。
结果:1. 成功分离出小鼠成纤维细胞。细胞增殖和细胞毒性实验结果显示,与PBS对照组相比,银杏内酯B的浓度在50μM时,成纤维细胞的增殖活性最好。2. 细胞划痕实验模拟创伤模型中,银杏内酯B的浓度为50μM时划痕愈合百分比最大。3. 银杏内酯B组小鼠毛囊由静止期转向生长期时间更短或者银杏内酯B组进入生长期的面积大于对照组。4. 流式细胞术显示,银杏内酯B能增加毛囊干细胞的增殖能力,以及促进毛囊干细胞(CD34+CD49f+)的表达。5. HE染色可观察到,银杏内酯B组的毛囊处于生长期状态的数量较多。6. Rt-PCR结果显示,银杏内酯B可以上调CD34和Krt15的RNA相对表达量,Wnt通路的相关基因Wnt5a、β-catenin、Lrp5的表达也被上调。
结论:1.银杏内酯B可以促进小鼠成纤维细胞的增殖能力和迁移能力;2.银杏内酯B对小鼠毛囊生长及毛囊周期转化具有一定的促进作用,其机制可能与上调Wnt通路的Wnt5a和Lrp5的表达促进毛囊干细胞的增殖能力有关。